• Hematoxilina Fosfotúngstica
• Hematoxilina de Harris + Eosina
• Método de Grocott  para fungos
• Métodos de Ziehl-Neelsen e Fite para bacilos ácido-resistentes
• Melanina (remoção)
• Azul de Alcian
• Método de Weigert - Van Gieson para elástico e colágeno
• Método de Verhoeff para elástico e colágeno
• Tricrômico de Masson
• Verde Metil Pironina
• Vermelho Congo Alcalino
• Giemsa - método de Wolbach modificado
• Escarlate R método de Herxheimer
• PAS - Reação do Ácido Periódico - Schiff
• Reticulina - método de Gomori
• Método de Von Kossa para cálcio
• Gram - método de Macallum-Goodpasture
• Mucicarmim
• Cristal Violeta
• Método de Warthin para Treponema
• Sudão Negro para gorduras
• Oil Red O para gorduras
• Pigmento de Formol em corte histológico (remoção)
• Método de Fontana-Masson para melanina
• Solução sulfocrômica
• Imunofluorescência Direta
• Método de Grimelius para neurosecreção
• Azul de Toluidina para substância metacromática
• Reação de Perls para Hemossiderina
• Luxol fast blue - Nissl para mielina e neurônios
• AGNOR
• DESCALCIFICADORES
• FIXADORES e especificação
• FERRO COLOIDAL DE MOWRY
• BIÓPSIAS DE MEDULA OSSEA
• MICROSCOPIA ELETRÔNICA

HEMATOXILINA FOSFOTÚNGSTICA

 

Hematoxilina	1 g
Água destilada	500 ml
Ácido Fosfotúngstico	20 g
Água destilada	500 ml

• Dissolver a Hematoxilina em 500 ml de água destilada com o auxílio de calor, sem ferver e agitando sempre.
• Dissolver o Ácido Fosfotúngstico em 500 ml de água destilada.
• Juntar as duas soluções e agitar.
• Guardar e envelhecer durante 6 meses.

 

Iodo	3g
Iodeto de Potássio	6g
Álcool 95%	300ml

1. Desparafinar e hidratar
2. Refixar em Bicloreto de Mercúrio, solução saturada por 24 horas
3. Passar em água destilada 3 vezes
4. Iodo Alcoólico 5% por 5 minutos
5. Passar em água destilada 3 vezes
6. Tiossulfato de Sódio 5% por 5 minutos
7. Passar em água destilada 3 vezes
8. Oxidar em Permanganato de Potássio 0,25% por 5 minutos
9. Passar em água destilada 3 vezes
10. Ácido Oxálico 5% por 10 a 20 minutos
11. Passar em água destilada 3 vezes
12. Corar pela HEMATOXILINA FOSFOTÚNGSTICA 24 horas
13. Salvar o corante e desidratar, diafanizar e montar.

RESULTADO: Fibras Colagenas azul escuro

 

Hematoxilina	5g
Álcool 95%	50ml
Sulfato de Alumínio e Potássio	100g
Água Destilada	1000ml
Óxido de Mercúrio	2,5g

• Dissolver a Hematoxilina no álcool e o Alúmen na água destilada com o auxílio de calor.
• Misturar as duas soluções e ferver o mais rápido possível.
• Remover da fonte de calor e juntar o Óxido de Mercúrio aos pouquinhos com cuidado, reaquecer até a fervura e contar um minuto.
• Afastar da fonte de calor e mergulhar em uma bacia com água e gelo imediatamente.
• Adicionar 4 ml de Ácido Acético, quando o corante estiver resfriado.

 

 

Eosina	2,5g
Água destilada	50 ml
Álcool 95%	200 ml
Álcool 80%	750 ml

• Dissolver a EOSINA na água destilada e acrescentar o álcool 95%
• Juntar os 750 ml de álcool 80% e mais 5 ml de Ácido Acético.

 

Fixação	Formalina	10%
Soluções	Ácido Crômico	solução aquosa a 5%
	Nitrato de Prata	solução aquosa a 5%
	Metenamina	solução aquosa a 3%
	Bórax	solução aquosa a 5%
	Bissulfito de Sódio	solução aquosa a 1%

 

Nitrato de Prata	solução aquosa a 5%	5 ml
Metenamina	solução aquosa a 3%	100 ml

* Ao juntar as soluções forma-se uma nuvem branca que se dissolve ao agitar.
 

 

Solução estoque de Metenamina-Nitrato de Prata	25 ml
Água destilada	25 ml
Solução de Bórax 5%	2 ml
Tiossulfato de Sódio	solução aquosa a 2%

1. Desparafinar, hidratar pelo álcool até a água corrente por 5 min
2. Oxidar em solução de Ácido Crômico a 5% durante uma hora
3. Lavar em água corrente por poucos segundos
4. Bissulfito de Sódio a 1% durante um minuto
5. Lavar em água corrente  5 minutos
6. Enxaguar em água destilada  3 a 4 passagens
7. Impregnar pela solução de trabalho de METENAMINA-NITRATO DE PRATA em estufa a 60ºC durante 30 a 60 minutos.
8. Controlar ao microscópio (crítico)* até que os fungos corem-se em marrom dourado.
9. Enxaguar em 6 trocas de água destilada
10. Remover a prata em excesso com tiossulfato de Sódio 2% por 3 min
11. Lavar em água corrente por 2 minutos
12. Corar os núcleos pela Hematoxilina de Harris por 5 segundos
13. Lavar em água corrente por 5 minutos
14. Desidratar, diafanizar e montar com Entellan.

Resultado: Fungos em marrom dourado;  Núcleos em azul
*impregnação em excesso cora outros componentes, principalmente fibras colágenas e núcleos, e atrapalha a visualização dos fungos.

MÉTODO DE ZIEHL-NEELSEN PARA BACILOS ÁLCOOL-ÁCIDO RESISTENTES
        (tuberculose, lepra)

 

Corante de Ziehl-Neelsen
	Fenol	8 ml
	Álcool Absoluto	20 ml
	Fucsina Básica (pó)	2 g
	Água Destilada	200 ml
Corante de Azul de Metileno
	Água destilada	99 ml
	Azul de Metileno	0,5 g
	Ácido Acético Glacial	0,5 ml
Diferenciador
	Álcool 70%	99 ml
	Ácido Clorídrico puro	1 ml
Mistura para desparafinar
	Xilol	60 ml
	Vaselina	30 ml

Procedimento:

1. Desparafinar na mistura xilol-vaselina por 10 minutos 2 vezes
2. Secar a  lâmina  em papel filtro dobrado
3. Corar pela Fucsina de Ziehl-Neelsen a quente: filtre o corante sobre o corte na lâmina em um suporte e aqueça com uma chama sob a lâmina até ver o vapor começar a subir da lâmina. Repetir por 3 vezes com 2 minutos de espaço entre os aquecimentos.
4. Lavar em água corrente para retirar o excesso do corante
5. Diferenciar no álcool-ácido cuidadosamente, revelando cor rósea no corte, e mergulhar na água corrente interrompendo a diferenciação
6. Lavar em água corrente por 10 minutos
7. Corar pelo Azul de Metileno por 1 minuto
8. Retirar o excesso em água corrente rapidamente
9. Desidratar, diafanizar e montar.

Resultado: Bacilos em vermelho; Núcleos em  azul

FRAGMENTOS; fixados em formol 10 % e cortes em parafina de 6 micrômetros
REAGENTES:
 

1-Xilol-óleo de Amêndoa
	Óleo de Amêndoa	1 parte
	Xilol	2 partes
2-Corante de Ziehl-Neelsen
	Preparo conforme técnica anterior [4]
3-Ácido Sulfúrico 2%
	Álcool 70% ou água destilada	98 ml
	Ácido Sulfúrico	2 ml

NOTA: Usar água ou álcool 70% conforme o micro organismo para ser evidenciado: se tuberculose use álcool 70%, se lepra use água

PROCEDIMENTO:

1. Desparafinar em 2  etapas de Xilol - óleo de Amêndoa por 12 minutos cada
2. Secar por compressão utilizando papel filtro dobrado
3. Secar ao ar
4. Corar em solução corante de Ziehl-Neelsen [filtrado] por 15 a 30 minutos em temperatura ambiente
5. Lavar em água corrente por 5 minutos
6. Diferenciar em [3] conforme nota acima
7. Lavar em água corrente por 5 a 10 minutos
8. Contracorar com Azul de Metileno por 1 minuto
9. Lavar em água corrente por 10 minutos
10. Secar em papel filtro. Completar a secagem agitando a lâmina ao ar e passagens em xilóis
11. Montagem em Permount ou Entellan

RESULTADO: Bacilos vermelho; Fundo azul

 

SOLUÇÃO DE PERMANGANATO DE POTÁSSIO
	Permanganato de Potássio	0,25 g
	Água destilada	100 ml
SOLUÇÃO DE ÁCIDO OXÁLICO
	Ácido Oxálico	5 g
	Água destilada	100 ml

PROCEDIMENTO:

1. Desparafinar e hidratar até a água corrente
2. Passar em água destilada
3. Colocar na solução de Permanganato de Potássio 0,25%, por 30 minutos a 1 hora, dependendo da quantidade do pigmento
4. Lavar demoradamente em água corrente e passar em água destilada
5. Colocar na solução de Ácido Oxálico a 5% até que o corte fique descorado
6. Lavar em água corrente por 10 minutos
7. Passar em água destilada
8. Corar qualquer coloração a seguir

 

SOLUÇÃO DE ÁCIDO ACÉTICO
	Ácido Acético Glacial	3 ml
	Água destilada	97 ml
SOLUÇÃO DE AZUL DE ALCIAN
	Azul de Alcian	1 g
	Solução de Ácido Acético a 3%	100 ml
SOLUÇÃO DE SAFRANINA
	Safranina	0,1 g
	Solução aquosa de Ácido Acético a 3%	100 ml

PROCEDIMENTO:

1. Desparafinar até a água corrente e água destilada
2. Corar pelo Azul de Alcian por 30 minutos
3. Lavar em água corrente por 10 minutos
4. Contracorar pela Safranina 0,1% por 1 minuto
5. Passar em água para retirar excesso
6. Desidratar, diafanizar e montar.

 

Corante de WEIGERT
	Fucsina Básica	2 g
	Resorcina	4 g
	Água destilada	200 ml

Preparo do corante de Weigert:

• Misturar em uma cápsula de porcelana bem limpa os elementos acima, aquecer até ebulir esta solução e permanecer ebulindo por 1 minuto, adicionar 25 ml de Cloreto Férrico solução aquosa a 29%.
• Esfriar, filtrar em um papel filtro dobrado (sanfonado), desprezar o líquido filtrado e salvar o precipitado com o papel filtro utilizado.
• Abrir o papel filtro contendo o precipitado na cápsula de porcelana e acomoda-la na estufa para que seque completamente.
• De posse da cápsula com o papel filtro e o precipitado seco, adicione 200 ml de álcool 95% e com o auxílio do calor, aqueça cuidadosamente a solução até dissolver o precipitado, retire do calor e remova o papel filtro da solução e deixe a solução esfriar naturalmente, adicione 4 ml de Ácido Clorídrico e adicione mais álcool 95% perfazendo o volume final de 200 ml.

Corante de VAN GIESON

 

Fucsina Ácida 1% solução aquosa	5 ml
Solução aquosa saturada de Ácido Pícrico	100 ml

HEMATOXILINA DE WEIGERT

 

Solução A
	Hematoxilina	1,0 g
	Álcool 95%	100 ml
Solução B
	Cloreto Férrico 29%	4,0 ml
	Água destilada	95,0 ml
	Ácido Clorídrico concentrado	1,0 ml

PROCEDIMENTO:

1. Desparafinar em Xilol, álcool até a água corrente
2. Corar pela Hematoxilina  Férrica de Weigert por 10 minutos. Misturar as soluções A e B em volumes iguais no momento do uso.
3. Lavar em água corrente por 10 minutos
4. Passar em álcool 95%
5. Corar pelo corante de Weigert por 30 minutos a 1 hora.
6. Lavar em água corrente por 5 minutos
7. Corar pelo corante de Van Gieson por 30 segundos
8. Desidratar diretamente, diafanizar e montar.

RESULTADO:

• Fibras elásticas - azul escuro
• Núcleos - azul a preto
• Colágeno - róseo a vermelho
• Outros elementos -  amarelo

Soluções estoque:

• Hematoxilina alcoólica 10%  (10 g de hematoxilina em 100 ml de álcool absoluto)
• Cloreto férrico 10%
• Solução de Iodo de Verhoeff.
• Iodo – 2 g.
• Iodeto de Potássio – 4 g.
• Água destilada 100 ml.

Solução corante diária de fibras elásticas.

• Hematoxilina alcoólica  10 %  -  25 ml.
• Álcool absoluto  - 25 ml.
• Cloreto férrico 10%  - 25 ml.

Misturar bem e adicionar  Solução de iodo de Verhoeff  - 25 ml.

Solução diferenciante :  Cloreto férrico 2%.

Procedimento.

1. Desparafinar e hidratar
2. Corar 15 min. na solução para fibras elásticas de Verhoeff.
3. Lavar em aguar corrente 20 min.
4. Passar por água destilada.
5. Diferenciar em cloreto férrico 2%, sob controle microscópico. Fibras elásticas devem salientar-se em negro contra fundo cinza claro.
6. Tiossulfato de sódio 5% - 1 min.
7. Lavar em água destilada 5 min.
8. Contracorar com solução de van Gieson 1 min. Tempo maior descora as fibras elásticas.
9 Desidratar rapidamente e montar (tempo de desidratação excessivo em álcool descora a solução de van Gieson).
 
 

 

SOLUÇÃO DE BOUIN
	Solução saturada de Ácido Pícrico	75 ml
	Formaldeído puro	25 ml
	Ácido Acético Glacial	5 ml
HEMATOXILINA FÉRRICA DE WEIGERT
	Solução A
	Hematoxilina pó	1 g
	Álcool 95%	100 ml
	Solução B
	Solução aquosa de Cloreto Férrico a 29%	4 ml
	Água destilada	95 ml
	Ácido Clorídrico Concentrado	1 ml
	Solução de trabalho: juntar na hora do uso partes iguais da solução A e B
SOLUÇÃO DE ESCARLATE DE BIEBRICH
	Solução aquosa de Escarlate de Biebrich 1%	90 ml
	Solução aquosa de Fucsina Ácida 1%	10 ml
	Ácido Acético Glacial	1 ml
SOLUÇÃO ÁCIDA FOSFOTÚNGSTICA-FOSFOMOLÍBDICA
	Ácido Fosfotúngstico	2,5 g
	Ácido Fosfomolíbdico	2,5 g
	Água destilada	100 ml
SOLUÇÃO DE AZUL DE ANILINA
	Azul de Anilina	2,5 g
	Ácido Acético Glacial	2 ml
	Água destilada	100 ml
SOLUÇÃO DE ÁGUA-ÁCIDO
	Água destilada	100 ml
	Ácido Acético Glacial	1 ml

PROCEDIMENTO:

1. Desparafinar e hidratar
2. Lavar em água corrente por 5 minutos
3. Mordentar em solução de Bouin por 1 hora na estufa a 60 graus ou preferencialmente deixar por uma noite em temperatura ambiente
4. Lavar em água corrente até desaparecer o amarelo deixado pela solução de Bouin
5. Passe em água destilada
6. Core pela solução de Hematoxilina Férrica de Weigert (A e B) por 10 minutos
7. Lavar em água corrente por 10 minutos
8. Passe em água destilada
9. Corar pela solução de Escarlate de Biebrich por 5 minutos
10. Passe por água destilada
11. Diferencie pela solução de Ácido Fosfotúngstico-Fosfomolíbdico durante 10 a 15 minutos
12. Passe por água destilada
13. Corar pela solução de Azul de Anilina durante 5 a 10 minutos
14. Lave em água destilada
15. Passe pela solução de Ácido Acético Glacial 1% por 3 a 5 minutos
16. Passe por água destilada
17. Desidrate, diafanize e monte em resina.

RESULTADO

• Núcleos - pretos
• Citoplasma, Queratina, Fibras intercelulares - vermelho
• Colageno e Muco - azul

Fixação: Formalina a 10 % tamponada ou Carnoy
Cortes de 4 mm

SOLUÇÕES:
 

SOLUÇÃO ESTOQUE DE VERDE METIL 1%
Verde Metil	1 g
Água destilada	100 ml
Extrair e purificar a solução de Verde Metil

Método:
1. Adicionar 100 ml de clorofórmio na solução estoque de Verde Metil e agitar bem
2. Deixar por várias horas no extrator ou durante a noite se possível, acondicionado em um funil de separação
3. Descartar o clorofórmio do separador
4. Repetir a operação até que o clorofórmio saia sem cor, usualmente na terceira vez é suficiente para remover as impurezas da solução
 

SOLUÇÃO ESTOQUE DE PIRONINA A 1%
Pironina GS	1 g
Água destilada	100 ml
Aqueça delicadamente a solução até dissolver o corante

SOLUÇÃO DE TRABALHO VERDE METIL PIRONINA
Solução estoque purificada de Verde Metil	70 ml
Solução estoque de Pironina GS 1%	30 ml

Ajustar o pH para 4.8 usando uma solução de Acetato de Sódio a 1%. Deixar o corante descansar por uma noite antes de usar. Não filtrar.

PROCEDIMENTO:
1. Desparafinar e hidratar até a água destilada
2. Filtrar sobre a lâmina a solução corante e deixar por 2 minutos
3. Por as lâminas entre papel filtro pressionando e secar no ar durante 5 minutos
4. Diferenciar individualmente com uma ou duas gotas de água destilada. Checar em microscópio e se os cortes estão vermelhos, diferencie rapidamente em álcool etílico a 80% -5 graus
5. Desidratar em acetona duas ou três mergulhadas rápidas
6. Completar passando em uma mistura de partes iguais de xilol-acetona e em duas passagens de Xilol por 1 ou 2 minutos cada
7. Montar em resina

RESULTADOS:

• Ácido Ribonucleico (RNA) vermelho
• Ácido Desoxiribonucleico (DNA).azul ou azul esverdeado

 

SOLUÇÃO ALCALINA.estoque
Álcool 80%	500 ml
Cloreto de Sódio	20 g
SOLUÇÃO ALCALINA.uso
Solução alcalina estoque	50 ml
Hidróxido de Sódio 1%	0,5 ml
SOLUÇÃO ALCALINA/VERMELHO CONGO.estoque
Álcool 80%	500 ml
Cloreto de Sódio	20 g
Vermelho Congo	1,25 g
SOLUÇÃO ALCALINA/VERMELHO CONGO.uso
Solução Alcalina/Vermelho Congo.estoque	50 ml
Hidróxido de Sódio 1%	0,5 ml
HIDRÓXIDO DE SÓDIO 1%
Água destilada	100 ml
Hidróxido de Sódio	1 g

As duas soluções estoque duram aproximadamente 30 dias
Agitar filtrar sempre antes do uso

PROCEDIMENTO

1. Desparafinar, hidratar até a água destilada
2. Hematoxilina durante 2 minutos
3. Lavar em água corrente por 5 minutos
4. Lavar em água destilada e passar em álcool 80%
5. Passar na solução alcalina por 20 minutos
6. Passar para a solução alcalina/Vermelho Congo por 60 minutos
7. Desidratar rapidamente em 3 banhos de álcool absoluto, Xilol e montar em resina

Resultado:

• Amilóide em róseo
• Núcleos azul

 

GIEMSA SOLUÇÃO ESTOQUE
Giemsa pó	3 g
Glicerina PA	198 ml
Metanol	198 ml

Dissolver o pó de Giemsa em Glicerina na estufa a 60 C por 2 horas e acrescentar o metanol após a retirada da estufa.

PROCEDIMENTO

1. Desparafinar e hidratar
2. Corar na solução corante de Giemsa diluída: 10 ml de solução estoque em 90 ml de água destilada, corar nesta solução por 1 hora. Preparar para a diferenciação: uma cubeta plástica com água destilada e três gotas de Ácido  Acético Glacial, uma cubeta plástica com álcool absoluto e três gotas de Ácido Acético, uma cubeta com álcool absoluto e duas com Xilol.
3. Mergulhar uma vez na cubeta contendo água acidulada
4. Mergulhar uma vez na cubeta contendo álcool acidulado
5. Controlar no microscópio e se for necessário repetir os passos  3 e 4
6. Mergulhar na cubeta de álcool absoluto até a lâmina esteja limpa
7. Mergulhar na seqüência xilol  e montar em resina

RESULTADO

• Núcleos azul
• Citoplasma  rosa
• Bactérias azul

 

Solução corante de ESCARLATE
Acetona	50 ml
Álcool 70%	50 ml
Escarlate R	0,3 g

Agitar e filtrar antes do uso, recuperar após o uso.
De tempo em tempo, adicionar pequena quantidade de acetona/álcool 70% na solução de Escarlate R para evitar a formação de precipitado.

PROCEDIMENTO:

1. Cortar em congelação cortes com 15 a 20 micra
2. Colher os cortes em água destilada
3. Passar em álcool 50%, 2 a 5 minutos
4. Passar os cortes diretamente para o corante de Escarlate R
5. Diferenciar em álcool 70% rapidamente
6. Passar em água destilada
7. Corar os núcleos pela Hematoxilina Harris
8. Passar os cortes novamente para a água destilada
9. Colher os cortes em lâminas, em uma vasilha com água
10. Montar com Gelatina/Glicerina

RESULTADO

• Núcleos azul
• Lípides vermelho vivo

SOLUÇÃO CORANTE:  REATIVO DE SCHIFF
Aquecer 200 ml de água destilada em um erlenmeyer de 500 ml até a ebulição.
Adicionar 1 g de Fucsina Básica (MERCK, granulada) cuidadosamente adicionando pouco a pouco, evitando a reação térmica, deixar abaixar a temperatura em 60 C aproximadamente e filtrar AGITANDO SEMPRE até que a temperatura abaixe à do ambiente. Adicione 20 ml de Ácido Clorídrico 1N *
Água destilada. 92 ml
Ácido Clorídrico. 8 ml
Adicione também 1 g de Metabissulfito de Sódio
Continuar agitando por mais 3 horas e deixar em repouso durante a noite.
Adicionar 1 g de carvão ativado.  Agite por 1 hora, filtre o corante e estoque em geladeira.
 

SOLUÇÃO DE ÁCIDO PERIÓDICO 0,5%
Cristais de Ácido Periódico	0,5 g
Água destilada	100 ml

PROCEDIMENTO

1. Desparafinar e hidratar
2. Oxidar em Ácido Periódico 0,5% por 15 minutos
3. Lavar em água corrente por 5 minutos e enxaguar na água destilada por 3 vezes
4. Corar em Reativo de Schiff por 30 minutos
5. Lavar em água corrente por 5 minutos
6. Contra corar pela Hematoxilina de Harris por 5 segundos
7. Lavar em água corrente por 5 minutos
8. Desidratar, diafanizar e montar em resina

RESULTADO

• Glicogênio, mucina, membrana basal, fungos -  vermelho
• Núcleos azul

Fixação: formol a 10%

Técnica: Parafina, cortes em 6-8 mm

Solução de Prata Amoniacal: estável por 2 semanas
Diluir em 10 ml de água destilada 1 g de Nitrato de Prata,
Diluir em 10 ml de água destilada 1g de Hidróxido de Potássio
Aos 10 ml de Nitrato de Prata a 10% juntar 2,5 ml de Hidróxido de Potássio a 10% em um erlenmeyer e nesta mistura precipitada adicionar 26 a 28 gotas de hidróxido de Amônio, agitando sempre quando for gotejando o Hidróxido de Amônio até que o precipitado desapareça quase completamente, restando alguns grânulos no fundo do erlenmeyer (se desejar dobre o volume com água destilada, de acordo com a técnica original)
Trabalhe com a vidraria muito limpa e livre de ácido

Solução de Permanganato de Potássio
Permanganato de Potássio.........0,5 g
Água destilada............................100 ml

Solução de Metabissulfito de Potássio
Metabissulfito de Potássio...........2,0 g
Água destilada............................100 ml

Solução de Formol

Formaldeído...............................20,0 ml
Água destilada...........................80,0 ml

Solução de Sulfato de Amônio Férrico (Alúmen de Ferro)
Sulfato de Amônio Férrico...........2,0 g
Água destilada............................100 ml

Solução de Cloreto de Ouro
Solução de Cloreto de Ouro a 1%..........20,0 ml
Água destilada..........................................80,0 ml

Solução de tiossulfato de Sódio
Tiossulfato de Sódio....................2,0 g
Água destilada...........................100 ml

PROCEDIMENTO:
1. Desparafinar e hidratar
2. Oxidar em Permanganato de Potássio 0,5% por 5 minutos
3. Lavar em água corrente por 2 minutos
4. Diferenciar em Metabissulfito de Potássio 2% por 5 minutos
5. Lavar em água corrente por 2 minutos
6. Sensibilizar  em Sulfato de Amônio Férrico 2% por 5 minutos
7. Lavar em água corrente por 5 minutos e passar em água destilada 3 vezes
8. Impregnar na solução de Prata Amoniacal (filtrando a solução sobre a lâmina) por 30 segundos despreze a solução utilizada
9. Lavar em água destilada rapidamente
10. Reduzir em Formol 20% por 3 minutos
11. Lavar em água corrente por 5 minutos
12. Passar em Cloreto de Ouro 0,2% por 10 minutos
13. Lavar em água destilada por 3 trocas
14. Passar em Metabissulfito de Potássio por 5 minutos
15. Lavar em água destilada 3 trocas
16. Passar em tiossulfato de Sódio 2% por 5 minutos
17. Lavar em água corrente por 2 minutos
18. Corar pela Hematoxilina de Harris por 5 segundos
19. Desidratar, diafanizar e montar

RESULTADO:   Fibras reticulínicas - preto

FIXAÇÃO: Formol 10% ou preferencialmente em Álcool,
Cortes 6 mm

Solução de NITRATO DE PRATA 5%
Nitrato de Prata......................5 g
Água destilada.................100 ml

Solução TIOSULFATO DE SÓDIO 5%
tiossulfato de Sódio...............5 g
Água destilada.................100 ml

Solução de SAFRANINA
Safranina...............................0,1 g
Ácido Acético Glacial............1 ml
Água destilada.....................99 ml

PROCEDIMENTO:
1. Desparafinar, hidratar
2. Passar por 3 vezes em água destilada
3. Gotejar sobre o corte na lâmina o Nitrato de Prata e submeta a luz solar por 30 minutos a 1 hora ou luz ultra violeta ou ainda a uma lâmpada de 100 watts
4. Enxaguar em água destilada
5. Passar em tiossulfato de Sódio 5%
6. Lavar em água destilada por 3 vezes
7. Contra corar os núcleos pela Safranina por 5 minutos
8. Desidratar, diafanizar e montar

RESULTADO:     Núcleo vermelho
                      Citoplasma rosa
                      Cálcio preto
 

Solução de GOODPASTURE
Fucsina Básica.................0,59 g
Anilina...............................1,00 ml
Álcool 30%...................100,00 ml
Fenol.................................1,00 ml

Solução de   STIRLING
Violeta de Genciana..........5,00 g
Anilina................................2,00 ml
Álcool absoluto......................10,00 ml
Água destilada......................88,00 ml

Solução Saturada de ÁCIDO PÍCRICO
Ácido Pícrico..............................1,18 g
Água destilada......................100,00 ml

Solução de IODO PARA GRAM
Iodo..................................1,00 g
Iodeto de Potássio.........2,00 g
Água destilada.........300,00 ml
PREPARAR: Dissolver em 3 ml de água destilada o IODO e em seguida dissolver na mesma solução o IODETO DE POTÁSSIO, sem acrescentar mais água, após completar acrescente os 297 ml de água restantes.

PROCEDIMENTO:
1. Desparafinar hidratar
2. Corar com GOODPARTURE por 10 minutos (agitar e filtrar sobre a lâmina)
3. Lavar em água destilada
4. Diferenciar em FORMALINA PA pura por 3 minutos
5. Lavar em água destilada
6. Corar o fundo com solução de ÁCIDO PÍCRICO por 3 a 5 minutos
7. Lavar em água destilada
8. Diferenciar em álcool 95% por 30 segundos
9. Lavar em água destilada
10. Corar no STIRLING por 3 minutos (filtrar sobre a lâmina no instante do uso)
11. Lavar em água destilada
12. Corar na solução de IODO/IODETO DE POTÁSSIO por 1 minuto
13. Enxugar as lâminas em papel filtro por compressão, mas deixando um pouco úmida
14. Mergulhar as lâminas em uma mistura de partes iguais de XILOL E ANILINA com várias trocas
15. Xilol com 2 trocas
16. Montar em resina
NÃO REUTILIZE O XILOL DESTA EM OUTRA COLORAÇÃO
A MISTURA DO XILOL/ANILINA É MUITO TÓXICA

 RESULTADO:         Bactérias Gram-positivas azul
                            Bactérias Gram-negativas vermelho
                            Outros elementos vermelho para púrpura

Solução Corante de MUCICARMIM
Carmim........................................1,0 g
Cloreto de Alumínio Anidro........0,5 g
Água destilada..........................2,0 ml
Misturar em um pequeno frasco de vidro os componentes listados e aquecer em uma fonte elétrica por 2 minutos. O líquido vai ficando vermelho escuro e consistência de xarope.
Diluir o conteúdo do frasco em 100 ml de álcool 50% e repousar por 24 horas.
Para o uso filtre em uma proveta um volume e acrescente 5 volumes de água destilada.

PROCEDIMENTO
1. Desparafinar e hidratar
2. Core pela Hematoxilina de Harris por 30 segundos
3. Lavar em água corrente por 5 minutos
4. Corar pelo corante MUCICARMIM por 30 minutos
5. Desidratar diretamente, diafanizar e montar

RESULTADO:         Núcleos - azul
                          Mucinas - róseo para vermelho
                          Outros elementos - amarelo

Fixação: Formalina a 10%
Cortes em parafina: 4 a 6 mm

SOLUÇÕES:

Cristal Violeta solução estoque
Cristal Violeta.................................14,0 g
Álcool etílico a 95%....................100,0 ml

Cristal Violeta solução funcionante

Solução estoque de Cristal Violeta.......10,0 ml
Água destilada.......................................300,0 ml
Ácido Clorídrico concentrado...................1,0 ml

Meio de Montagem
Gelatina.................................10,0 g
Água destilada...........................60,0 ml
Aquecer até a gelatina dissolver e adicionar:
Fenol.............................................1,0 ml

PROCEDIMENTO:
1. Desparafinar e hidratar até a água destilada
2. Corar na solução funcionante de Cristal Violeta 5 horas
3. Lavar em água corrente por 15 minutos
4. Montar as lâminas com o meio de montagem ou se preferir deve secar as lâminas no ar
5. Quando desejar examinar coloque uma gota de água destilada e recubra com uma laminula

RESULTADO:         Amilóide  -  violeta púrpura
                           Outros elementos  -   azul

Fixação: Formalina 10% tamponada
Cortes em parafina de 6 mm

SOLUÇÕES TAMPÃO
1-Água Tamponada pH 3,6
Acetato de Sódio..............16,4 g
Água destilada...............1000,0 ml

2-Ácido Acético Glacial 11,8%
Água destilada..................100,0 ml
Ácido Acético Glacial.........11,8 ml
 

Preparar a solução tamponada pH 3,6 misture:
Solução-1..............3,0 ml
Solução-2............37,0 ml
Água destilada.960,0 ml

3-Nitrato de Prata 1%
Nitrato de Prata...............1,0 g
Água destilada...........100,0 ml

A-  Hidroquinona 3%
Hidroquinona....................0,3 g
Água Tamponada.........10,0 ml

B-  Gelatina 5%
Gelatina neutra.............5,0 g
Água destilada........100,0 ml

C-  Nitrato de Prata 2%
Nitrato de Prata...........0,5 g
Água destilada.........25,0 ml
*Preparar todas as soluções, manter somente a solução de Nitrato de Prata na estufa 60-65 C e misturar as soluções na ordem:
Solução Hidroquinona (A).............4 ml
Solução Gelatina (B)....................60 ml
Solução de Nitrato de Prata (C)..12 ml

PROCEDIMENTO
1. Desparafinar hidratar até a água destilada
2. Impregnar na solução de Nitrato de Prata a 1% (preparada em água tamponada) na estufa a 60 C por uma hora
3. Lavar rapidamente em água bi-destilada ou deionizada
4. Revelar na solução Hidroquinona/Gelatina/Nitrato de Prata (ABC) até ficar castanho dourado, de 3 a 4 minutos
5. Lavar em água tamponada por 3 minutos
6. Desidratar, diafanizar e montar

RESULTADO:         Espiroquetas -  negras
                           Fundo -  castanho amarelado

SUDÃO NEGRO  PARA GORDURAS

Cortes de congelação ou em parafina

Preparar em uma cubeta com álcool 70% solução saturada de SUDÃO NEGRO
A técnica é própria para cortes de congelação, se preferir fazer em lâminas com cortes de parafina não terá o mesmo resultado.

PROCEDIMENTO
1. Cortes de congelação em água destilada
2. Colocar em álcool 50% por 2 minutos
3. Corar pelo SUDÃO NEGRO por 30 minutos (filtrar no uso)
4. Passar em álcool 50% por 2 minutos para diferenciar
5. Colocar em água destilada
6. Pescar em lâminas
7. Montar em glicerina/gelatina  =  TÉCNICA 18

RESULTADO: Lípides em preto

OIL RED  O  PARA  GORDURAS

Solução estoque.
Dissolver Oil Red O em 20 ml de isopropanol (álcool isopropílico), misturar bem e deixar em repouso por 20 min.  Esta solução é estável por 1 ano.
Solução de trabalho. Misturar 3 partes de solução estoque e 2 partes de água destilada, Deixar 10 min. em repouso.  Filtrar imediatamente antes do uso.
Uso só em cortes de congelação, colhidos preferencialmente em lâminas silanizadas, esfregaços ou imprints.
Incubar cortes em álcool isopropílico 60% por 2 minutos.
Incubar cortes na solução de trabalho por 6 min.
Diferenciar em álcool isopropílico 60% por 1 min.
Lavagem em água destilada 2x
Contracorar com hematoxilina 1-2min.
Lavar 3 x em água destilada
Montar em meio aquoso (geléia de glicerina).
Fonte – Dubowitz V, Sewry CA.  Muscle Biopsy, a practical approach.  3rd Ed. Saunders, Elsevier, 2007.  p. 31.
 

SOLUÇÃO DE ÁLCOOL AMONIACAL
Amônia PA...........................1,0 ml
Álcool 75%.......................200,0 ml

PROCEDIMENTO
1. Desparafinar e lavar em água corrente
2. Submeter a solução de ÁLCOOL AMONIACAL durante 30 minutos
3. Lavar por 10 minutos
4. Seguir a coloração ou reação...

SOLUÇÃO DE PRATA AMONIACAL
Dissolver 10 g de Nitrato de Prata em 100 ml de água destilada
Separar 95 ml desta solução e nesta adicionar o Hidróxido de amônio em gotas, tornando a princípio a solução precipitada.  Com a adição do Hidróxido de Amônio o precipitado dissolve-se
Se a solução ficou clara utilize os 5 ml de Nitrato de Prata 10% para torna-la opalescente
Deixe em repouso por uma noite
Da solução pronta para o uso, utilize 25 ml e acrescente 75 ml de água destilada e filtre

SOLUÇÃO CORANTE DE SAFRANINA
Safranina...................................0,1 g
Água destilada....................100,0 ml
Ácido Acético Glacial.............1,0 ml

SOLUÇÃO DE CLORETO DE OURO 0,2%
Solução estoque de Cloreto de Ouro 1%...10,0 ml
Água destilada...............................................40,0 ml

SOLUÇÃO DE TIOSSULFATO DE SÓDIO 5%
Tiossulfato de Sódio..................5,0 g
Água destilada.....................100,0 ml

PROCEDIMENTO
1. Desparafinar e hidratar até a água destilada
2. Impregnar na solução de Nitrato de Prata/Amoniacal filtrada para o uso, e por na estufa a 56 C por uma hora. Os cortes tornam-se marrom claro
3. Enxaguar em água destilada
4. Submeter em Cloreto de Ouro 0,2% por 10 minutos
5. Enxaguar em água destilada 3 vezes
6. Reduzir em Tiossulfato de Sódio 5% por 5 minutos
7. Enxaguar em água destilada 3 vezes
8. Corar os núcleos pela solução Corante de Safranina por 5 minutos
9. Enxaguar em água destilada por 2 vezes
10. Desidratar, diafanizar e montar

RESULTADO:         Núcleos rosa
                           Grânulos argentafins -  preto

Bicromato de Potássio....................60,0 g
Água destilada..............................200,0 ml
Ácido Sulfúrico..............................200,0 ml

Dissolver o Bicromato de Potássio em água destilada e acrescentar aos poucos o Ácido Sulfúrico, utilize o frasco próprio para suportar o calor da reação do ácido com a água, a solução deve precipitar e nesta fase acrescente um pouco de água destilada para que o precipitado desapareça mas fique no limite UTILIZAR ERLENMEYER COM NO MÍNIMO O TRIPLO DO VOLUME A SER PREPARADO

Vidrarias devem ser submetidas a solução Sulfocromica por no mínimo 20 minutos

Os conjugados de Fluorescência são obtidos comercialmente de diversas marcas e nossa experiência: Behring e Dako.
As reações desenvolvidas neste serviço são: IgA, IgG, IgM, C3c, C1q, Kappa, Lambda e Fibrinogênio.
1. Após a reconstituição com água destilada, dividir em alíquotas de 50 ml e conserva-las em freezer a -20  C.
2. Preparar a solução de PBS
 Cloreto de Sódio.......................8,0 g
 Cloreto de Potássio................0,81 g
 Fosfato de Sódio(Na2HPO4)..........1,15 g se Na2HPO4 12H2O: 2,42 g
 Fosfato de Potássio(KH2PO4).......0,20 g
 Dissolver em 1000 ml de água destilada e medir o pH
3. Preparar a solução Azul de Evans / PBS
 Azul de Evans......................0,01 g
 Solução de PBS.................100 ml
4. Rediluir a solução de Azul de Evans/PBS
 Solução Azul de Evans/PBS...........10 ml
 Solução PBS.....................................90 ml
 Filtrar esta solução
5. Separar das alíquotas uma amostra de cada para uso e acrescentar aos 50 ml mais 1 ml de solução de Azul de Evans/PBS rediluido(4) e conservá-las em geladeira a +4 C
6. As biópsias são incluídas em Tissue- TeK, congeladas em  Nitrogênio Líquido e cortadas em criostato a -24 C.
7. Os cortes colhidos em lâminas silanizadas e secos ao ar são acomodadas em uma cuba e imersas em PBS por 15 minutos.
8. Colocar o conjugado rediluido: IgA-IgM-IgG-C3c-C1q-Kappa-Lambda-Fibrinogênio em centrífuga e centrifugar por 15 minutos com 9000 RPM  (na hora do uso).
9. Incubar em câmara úmida por 30 minutos a temperatura ambiente
10. Lavar cuidadosamente os cortes, escorrendo sobre eles a solução de PBS .
11. Mergulhar na solução de PBS  por 10 minutos e repetir mais 10 minutos com nova solução.
12. Montar com lamínula sob solução PBS/glicerina na proporção 1/2

Solução A (impregnadora)
150 ml de água destilada
2 ml de Nitrato de Prata a 2%

A água deve ser aquecida até a ebulição e separando 50 ml desta água adicionar 2 ml da solução de Nitrato de Prata a 2% e aguardar a temperatura abaixar a 60 C

Solução B (reveladora)
100 ml de água destilada
5 g de Sulfito de Sódio
1 g de Hidroquinona
Aquecer os 100 ml de água destilada até a ebulição e adicionar os sais (Sulfito de Sódio e Hidroquinona) e aguardar a temperatura abaixar até 60 C

Corante Nuclear: SAFRANINA
Safranina....................0,1 g
Água destilada...........99 ml
Ácido Acético...............1 ml

PROCEDIMENTO:
1. Desparafinar e hidratar
2. Lavar em água destilada exaustivamente
3. Submeter na solução A por 3 minutos a 65 C
4. Lavar em água destilada a 65 C
5. Submeter na solução B por 1 minuto
6. Lavar em água destilada a 65 C
7. Repetir na solução A por 1 minuto a 65 C
8. Lavar em água destilada a 65 C
9. Repetir na solução B por 1 minuto
10. Lavar em água destilada a 65 C
11. Lavar em água destilada em temperatura ambiente
12. Corar os núcleos pela Safranina por 1 minuto
13. Desidratar, diafanizar e montar com resina

RESULTADO: grânulos argentafins impregnados (amarelo/marrom/negro)
                         núcleos em vermelho

Fixação: Formalina a 10%
Cortes em parafina de 6 mm

AZUL DE TOLUIDINA
Azul de Toluidina.....................0,1 g
Água destilada......................100 ml

PROCEDIMENTO:
1. Desparainar e hidratar, após água destilada
2. Corar pelo Azul de Toluidina por 30 minutos
3. Enxaguar em água destilada
4. Cubra o corte com laminula sobre uma gota de água destilada
5. Moldure a laminula com cera aquecida
Recomendamos usar uma lâmina controle com um corte de cordão umbilical

RESULTADO: Substância metacromática em róseo

Fixação: Formalina a 10 %
Cortes em parafina de 5 mm

Soluções:
A- Solução FERROCIANETO DE POTÁSSIO
Ferrocianeto de Potássio......................2,5 g
Água destilada........................................25 ml
B- Solução ÁCIDO CLORÍDRICO
Ácido clorídrico..................................5 ml
Água destilada.................................20 ml
Misturar a solução A e B em partes iguais (25 + 25) sempre no instante do uso
Solução corante de SAFRANINA
Safranina.............................0,1 g
Água destilada...................99 ml
Ácido Acético Glacial..........1 ml
 

PROCEDIMENTO:
1. Desparafinar e hidratar
2. Passar em água destilada
3. Submeter a solução Cloridríco-Ferrocianeto por 1 hora
4. Enxaguar em água destilada por 3 vezes
5. Contracorar pela Safranina por 2 minutos
6. Passar em água para diferenciar (controle ao microscópio)
7. Desidratar, diafanizar e montar

RESULTADO: Pigmento Férrico azul
   Núcleos vermelho
 

Fixação – Formol 10%.

Soluções :

Luxol-fast-blue 0,1%

Luxol-fast-blue MBS 0,1 g.
Etanol 95%  100 ml.

Dissolver o corante no álcool. Acrescentar 0,5 ml de ácido acético 10% por 100 ml de solução. A solução é estável por meses.

Cresil – violeta 0,1%.

Cresil violeta 0,1 g.
Água destilada  100 ml.

Imediatamente antes do uso, adicionar 15 gotas de ácido acético a 10%. Filtrar antes do uso.

Carbonato de lítio 0,05 %.

Carbonato de lítio  0,05 g.
Água destilada  100 ml.

Procedimento.

Cortes de parafina, preferivelmente entre 15 a 20 micrômetros.
Desparafinar, chegar ao álcool 95 %.
Corar pela solução de luxol fast blue durante a noite em estufa a 56%. (Usar recipiente bem vedado para não evaporar;  exemplo - tubete para lâminas com rosca).
Retirar excesso de corante com álcool 95 %.
Enxaguar em água destilada.
Diferenciar lâminas uma a uma na solução de carbonato de lítio, cerca de 30 segundos – o excesso de corante começa a sair.
Continuar a diferenciação em álcool 70% e ir agitando gentilmente até que a diferença entre substância branca e cinzenta fique nítida.
Repetir a seqüência do carbonato de lítio e álcool 70% (se necessário) até que a substância cinzenta esteja bem clara (aconselha-se acompanhamento ao microscópio).
Terminada a diferenciação coletar todas lâminas em água destilada.
Corar por solução de cresil violeta 6 min.  Pode-se também usar HE, só hematoxilina ou PAS como contracolorações.
Desidratar rapidamente em etanol 95 e absoluto. Obs. Desidratação prolongada pode prejudicar a coloração dos neurônios por cresil violeta.
Xilol. Montagem em Entellan.

Resultados : mielina – azul turquesa;  neurônios – azul violeta.
 

SOLUÇÃO A: 2g de gelatina dissolvida em 100 ml de água destilada pré aquecida. Adicionar 1g de ácido fórmico.

SOLUÇÃO B: nitrato de prata a 50%

MODO DE PREPARO

1. Misturar na hora do uso 1 volume de solução A com 2 volumes de solução B. Colocar diretamente sobre o esfregaço. Deixar por trinta minutos, no escuro e à temperatura ambiente.
2. Lavar em água destilada.
3. Colocar em metabissulfito de sódio a 1% por 1 a 3 minutos.
4. Lavar em água destilada.
5. Colocar tiossulfato de sódio a 2% por 1 a 3 minutos.
6. Lavar com água destilada.
7. Seguir o procedimento habitual de montagem com resina sintética.

RESULTADOS: nucléolos em negro

ANTES DE DESCALCIFICAR QUALQUER TECIDO ÓSSEO SÃO NECESSÁRIOS DOIS PASSOS - ESTAR FIXADO ADEQUADAMENTE E SERRADO NA ESPESSURA DE NO MÁXIMO 5 mm.  APÓS DESCALCIFICADO REDUZIR A 3 mm

ÁCIDO NÍTRICO 7%
Água destilada.................930 ml
Ácido Nítrico.......................70 ml
IMPORTANTE: deitar o ácido sobre o volume total de água e nunca o contrário

ÁCIDO FÓRMICO - CITRATO DE SÓDIO
Solução A
Água destilada...................250 ml
Citrato de Sódio....................50 g

Solução B
Água destilada.........................125 ml
Ácido Fórmico puro.................125 ml
No instante do uso juntar partes iguais da solução A e B
Este descalcificador preserva bem a morfologia do tecido embora seja muito lento. É recomendado para fragmentos pequenos

DESCALCIFICADOR USADO NO DEP. DE ANATOMIA PATOLÓGICA
DO HOSPITAL GERAL DE MASSACHUSETTS E NO L.A.P. UNICAMP
EDTA, Tetrasódio.............................7 g
Tartarato de Sódio e Potássio......80 g
Tartarato de Sódio.................1,4 g
Ácido Clorídrico.................1200 ml
Água destilada...................9000 ml
1. A escolha das marcas das drogas deste descalcificador tem que ser criteriosa na qualificação
2. Todo tecido tem que estar fixado e recortado no tamanho correto, preferencialmente fixado durante a noite.
3. Submeter o tecido ao descalcificador no máximo 8 horas.  Conforme o tamanho e concentração de cálcio no fragmento o tempo pode variar de 2 a 8 horas.  Se necessário mais tempo, nunca deixe o fragmento no descalcificador durante a noite. Repita a operação durante o dia.
4. Teste os fragmentos com um alfinete ou uma lâmina de bisturi, se ao penetrar no tecido ranger revelando textura vítrea continue o processo
5. Concluído o processo de descalcificação lave em água corrente por uma hora, não deixe lavando durante a noite, conserve em álcool 70%

 

1-FORMALINA TAMPONADA (biópsia de todos órgãos)
	Formol	100 ml
	Água destilada	900 ml
	Fosfato de Sódio Monobásico	4 g
	Fosfato de Sódio Dibásico	6,5 g
	Este fixador é de uso geral
2-BOUIN (biópsia de testículo e rim)
	Solução saturada de Ácido Pícrico aquoso	750 ml
	Formol	250 ml
	Ácido Acético Glacial	50 ml
	Fixar de 4 a 6 horas, conservar em álcool 70 % até o processo seguinte.
3-DUBOSQUE-BRASIL (biópsia de rim)
	Formol	120 ml
	Ácido Acético	30 ml
	Ácido Pícrico	2 g
	Fragmento filiforme de rim neste fixador por 1 hora no máximo, a duração do fixador é de 15 dias
4-CARNOY (biópsia pequena)
	Álcool absoluto	60 ml
	Clorofórmio	30 ml
	Ácido Acético Glacial	10 ml
	Fixador rápido, deixar no máximo por 1 hora e iniciar o processo em álcool absoluto por 30 minutos, dois Xilois com 15 minutos cada e duas passagens de parafina com 15 minutos cada em seguida a incusão.
5-ZENKER (biópsia de medula)
	Água destilada	1000 ml
	Cloreto de Mercúrio	50 g
	Dicromato de Potássio	25 g
	Sulfato de Sódio	10 g
	Adicionar 5 ml de Ácido Acético Glacial para 95 ml da solução de Zenker na hora do uso, nele permanece por 24 horas e lavar por 3 a 6 horas em água corrente

Fixação; formol neutro a 10%
Cortes em parafina; 6 mm
 

1-Solução Cloreto Férrico a 29%
2-Solução FERRO COLOIDAL DE MULLER estoque
	Água destilada	250 ml
	Levar até a ebulição e adicionar a
	Solução de Cloreto Férrico 29%	4,4 ml
3-Solução de trabalho FERRO COLOIDAL DE MULLER
	Solução estoque de FERRO COLOIDAL DE MULLER	20 ml
	Água destilada	15 ml
	Ácido Acético Glacial	5 ml
4-Solução aquosa de Ácido Acético Glacial 12%
5-Solução aquosa de Ácido Clorídrico 5%
6-Solução aquosa de Ferrocianeto de Potássio 5%
7-Solução de trabalho Ferrocianeto de Potássio 5%/Ácido Clorídrico 5%
	Ferrocianeto de Potássio a 5%	40 ml
	Ácido Clorídrico a 5%	40 ml
8-Corante de Van Gieson ou Fast Red

PROCEDIMENTO:

1. Desparafinar e hidratar até a água destilada
2. Por durante 3 minutos em solução de Ácido Acético Glacial 12%
3. Submeter em solução  trabalho de Muller por 1 hora (3)
4. Enxaguar em solução aquosa de Ácido Acético Glacial 12% em 4 etapas, durante 3 minutos cada.
5. Submeter as lâminas pela solução de trabalho de Ferrocianeto de Potássio/Ácido Clorídrico por 20 minutos
6. Lavar em água corrente por 5 minutos
7. Enxaguar em água destilada
8. OPCIONAL - Contracorar com solução corante de Van Gieson por 5 a 7 minutos ou solução corante de Vermelho Rápido por 5 minutos
9. Desidratar e diafanizar
10. Montar com resina

RESULTADOS: Mucopolisacarídeo ácido - Azul

Para biópsias de medula ossea de agulha em adulto utilizar o fixador de ZENKER, e para biósia de medula ossea de agulha em criança utilizar o formol 10% e após a fixação do fragmento descalcifique em Ácido Fórmico 30% por 18 a 24 horas.

PROCESSO

Medula ossea (biópsia de agulha) em ZENKER por 18 a 24 horas
• Lavar em água corrente por 4 a 6 horas
• Se houver impedimento para prosseguir com o processo, coloque a medula ossea em cápsula e mergulhe em Alcool 80%
• Segue:

 

1-Alcool 90%	15 minutos
2-Alcool absoluto	30 minutos
3-Alcool absoluto	30 minutos
4-Alcool absoluto	30 minutos
5-Xilol	30 minutos
6-Xilol	30 minutos
7-Parafina a 62C	30 minutos
8-Parafina a 62C	30 minutos
9-INCLUSÃO

Solução  de  Karnovsky –

Paraformaldeído – 2 g.
Água distilada – 20 ml.
Aquecer a 60º C e juntar gotas de NaOH 1 N até dissolver.  Esfriar.
Glutaraldeído a 50%   - 12 ml
Cacodilato de sódio – 8,56 g.
Água distilada – 200 ml.  Acertar pH para 7.2. Usar 70 ml.

Resultado final:
Paraformaldeído a 1 %
Glutaraldeído a 3%  em
Tampão Cacodilato 0,07 M

Tetróxido de ósmio (OsO4) –
Dissolver 1 g em 50 ml de água distilada.
Quebrar ampola de OsO4 em um vidro âmbar, com a água e deixar durante a noite (dissolução muito lenta)
Ampolar alíquotas de 1 ml  (para evitar inalação de vapores, substância tóxica)
Para usar – misturar 1 : 1 com tampão cacodilato 0,07 M, pH 7,2.
Fragmentos ficam 2 hs. no fixador.

Acetato de Uranila (Corante em bloco) –
Acetato de Uranila  -  0,5 g.
Sacarose  -  9,9 g.
Água distilada – 100 ml.
Após o ósmio, deixar uma noite na geladeira nesta solução.  Daí passa à desidratação e inclusão.

Desidratação –
Em séries crescentes de acetona ou  etanol – óxido de propileno
(As resinas são solúveis em acetona mas não em etanol. Óxido de propileno faz a transição para permitir infiltração pela resina).
Acetona 30% - 30 min.
Acetona 50% - 15 min.
Acetona 70% - 15 min.
Acetona 90% - 15 min.
Acetona 100% - 15 min.
Acetona 100% - 15 min.
Acetona / resina (1:1) no rotor  - 2 hs.
Resina na estufa a 37º C  - 1 h.
Inclusão em resina Araldite.

Corante para cortes grossos (1 m)
Azul de toluidina – 1 g.
Bórax  -  1 g.
água distilada  -  100 ml.
Filtrar.  Corar em chapa quente.
Aquecer até levantar vapor, sem deixar secar.
Lavar em água corrente.
Observar sem lamínula  (gota de óleo de imersão opcional)
Secar e guardar.

Contrastante para cortes ultrafinos (0,1 m) -  Citrato de chumbo de Reynolds (1963) –

Nitrato de chumbo  2,66 g
Citrato de sódio 3,52 g
Água distilada 60 ml.
Dissolver em balão de vidro agitando forte por 1 min, lentamente por 30 min, até desaparecerem os grânulos finos.
Adicionar 16 ml de NaOH 1 N  (1 g de NaOH em 25 ml de água distilada e previamente fervida para eliminar todo CO2).
Solução torna-se transparente
Completar para 100 ml.
Filtrar com filtro millipore antes do uso.
 

AGRADECIMENTOS:

SEBASTIÃO HENRIQUE MILITÃO
LÉA DE MAGALHÃES
MARIA JOSÉ TIBÚRCIO SILVESTRE
SÍLVIA HELENA ROCHA E SILVA
LUZIA M. R. REIS
CARLOS APRIGIO DOS SANTOS
APARECIDO PAULO DE MORAES
DIVANI DE FÁTIMA DE ALMEIDA NEDER
MARIA RITA GOMES DA CRUZ CONDE
SÉRGIO ROBERTO CARDOSO
VANESSA CRISTINA FONSECA ROQUE
MARIA SALETE MENDES
MARIAGINA DE JESUS GONSALVES
ANA ALZIRA DA SILVA
Dra. LUCIANA G.A. LIMA

Ismael Vêncio
Técnico responsável (aposentado)

Revisto em 11/11/2011 por Prof. Luciano de Souza Queiroz.